#大肠杆菌#
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前言
在生物制药产业的各个工段中，发酵流程处于最前端也是最基础的位置，并对整个生产流程产生重要的影响。其中发酵流程中最为重要的就是前期的灭菌处理，这也是避免噬菌体感染的最主要方法。
了解各种灭菌方法对于项目的有效推进有重大的意义，今天菌菌就和大家一起了解在发酵流程中最为常用的几种灭菌方法。
常用的消*灭菌方法主要有：热灭菌法（干热、湿热、火焰）、辐射灭菌法、化学药品灭菌法、臭氧灭菌法、过滤除菌法等。
在发酵工业中经常需要对某些物品或产品以及使用和生产这些物品或产品所需的原辅料、包装材料、设备、工器具、生产设施与环境进行必要的消*和灭菌，甚至包括操作人员同样需要采取必要的消*与灭菌措施，以确保经消*与灭菌后的物品或产品符合规定的质量标准。
消*与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消*是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，用于牛奶、啤酒和酿酒原汁等的巴氏消*法，是将物料加热至60℃维持30min，以杀死不耐高温的物料中的微生物营养细胞。灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消*不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消*的目的。
一、火焰灭菌法
直接在火焰上灼烧灭菌，该方法简单有效，但局限性很大。（1）适用于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶等无菌操作，需要与酒精灯配合使用；（2）适用于各类不易染菌或对染菌控制要求不是特别严格的接种操作，比如酵母类接种大多数即可用火焰保护接种，需与火焰圈配合使用。
二、干热灭菌法
干热灭菌主要运用微生物细胞在高温条件下发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中*等作用而导致微生物死亡。干热灭菌所需的温度较高，时间较长，一般-℃，1-1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。
三、湿热灭菌法
湿热灭菌通常利用饱和蒸汽进行灭菌。其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热蒸汽存在潜热。蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为℃，30min。然而巴氏消*法通产是加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消*法。牛奶、啤酒、*酒、酱油和醋等用此法消*。
四、辐射灭菌法
辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物，以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，且距照射物不超过1.2m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。
射线灭菌适用范围比较局限，该灭菌方法只能达到表面灭菌的效果，一般适用于无菌室，无菌箱、器皿表面及超净工作台等的消*，由于此类环境中常有目标菌及工作菌的存在，我们需要在保证工作菌或目标菌活性的前提下对环境杂菌进行控制。
五、化学药品灭菌法
化学药品灭菌法指运用某些化学药品与微生物发生反应而导致微生物蛋白变性、酶失活以及细胞通透性改变而死亡。化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。常用化学药品有高锰酸钾溶液、漂白粉、乙醇、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类等。
化学灭菌法可分为两类：
化学气体灭菌法的挥发性质，可使灭菌气体到达封闭空间的各个细微角落，常用于环境空气的灭菌及一些表面的灭菌，如：高锰酸钾灭菌法、甲醛熏蒸法；
化学液体灭菌法在生物行业最常用的是75%酒精的使用，此类方法对人体的伤害较小，因而得以广泛使用。
六、臭氧灭菌
臭氧灭菌主要是利用臭氧氧化分解微生物内部氧化葡萄糖所需要的酶，并破坏细胞膜，杀死细菌。在GMP验证过程中我们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧灭菌有许多特点：臭氧为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分布均匀；臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底，杀菌能力与过氧乙酸相当，高于其它消*剂；臭氧广谱杀菌，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病*、真菌等，并可破坏肉*杆菌*素，另外，臭氧对霉菌也有极强的杀灭作用。
臭氧制备是利用我们周围的大气制取（臭氧发生器），现制现用，不需储藏设施，节省原料储储所需的占地面积。臭氧主要用于洁净室、净化设备的消*。
七、过滤除菌
过滤除菌指用适当的过滤材料对液体或气体进行过滤除去微生物。此法主要用于热敏性物质的灭菌和发酵用无菌空气的制备。该除菌方法有两个应用方向：
（1）物料除菌：发酵培养基的成分需要添加适量维生素，而维生素本身不耐高温，此时可通过滤头过滤杂菌达到无菌目的（PS.滤头方案仅适用于实验室规模）；
（2）环境除菌：无菌空间的灭菌方案除了上述的化学气体之外，一般还需提请进行空气过滤除菌，尤其是对大型无菌空间环境。
常用的过滤除菌有绝对介质过滤和深层介质过滤：绝对介质过滤的介质滤孔小于细胞和孢子。一般采用0.2微米微孔滤膜。深层介质过滤介质的孔隙一般大于微生物细胞，如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。其原理为当微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。
总结
在进行发酵操作之前对物料、设备、人员进行良好的消*灭菌处理对后续的发酵以及其他生产阶段都有益处。在很多产生噬菌体感染的案例中，最主要的原因就是消*灭菌能力不够导致消*灭菌不彻底，进而影响整体项目的进展。